科普：“基因敲除狗”的來源

1.“記錄”入侵者檔案

其中的“間隔序列”來源于病毒或外源質粒的一小段DNA，是細菌對這些外來入侵者的“記錄”。（如圖A所示）。

▲圖1 CRISPR序列示意圖

病毒或外源質粒上，存在“原間隔序列”，“間隔序列”正是與它們互相對應�！霸�間隔序列”的選取并不是隨機的，這些原間隔序列的兩端向外延伸的幾個堿基往往都很保守，我們稱為PAM（Protospacer adjacent motifs-原間隔序列臨近基序）。

當病毒或外源質粒DNA首次入侵到細菌體內時，細菌會對外源DNA潛在的PAM序列進行掃描識別，將臨近PAM的序列作為候選的“原間隔序列”，將其整合到細菌基因組上CRISPR序列中的兩個“重復序列”之間。這就是“間隔序列”產生的過程。

2、打擊二次入侵者

當外源質�；虿《驹俅稳肭炙拗骶鷷r，會誘導CRISPR序列的表達。同時，在CRISPR序列附近還有一組保守的蛋白編碼基因，稱為Cas基因。CRISPR序列的轉錄產物CRISPR RNA和Cas基因的表達產物等一起合作，通過對PAM序列的識別，以及“間隔序列”與外源DNA的堿基互補配對，來找到外源DNA上的靶序列，并對其切割，降解外源DNA。這也就實現(xiàn)了對病毒或外源質粒再次入侵的免疫應答。

正是基于細菌的這種后天免疫防御機制，CRISPR/Cas9技術應運而生，從而使科學家們利用RNA引導Cas9核酸酶實現(xiàn)對多種細胞基因組的特定位點進行修飾。

三、CRISPR/Cas9技術的實現(xiàn)需要什么？

在CRISPR/Cas9技術中，我們把即將被編輯的細胞基因組DNA看作病毒或外源DNA�；�因編輯的實現(xiàn)只需要兩個工具——向導RNA（guide RNA, gRNA）和Cas9蛋白。

其中，向導RNA的設計并不是隨機的，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對保守的PAM序列（即三堿基序列NGG，其中N可以是任意堿基），而且向導RNA要與PAM上游的序列堿基互補配對。以基因敲除為例，如圖3所示，在待敲除基因的上下游各設計一條向導RNA(向導RNA1，向導RNA2)，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質粒一同轉入細胞中，向導RNA通過堿基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白會使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。

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